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技术支持

酶抑制法快速检测化学污染物
发布时间:2019-03-19   点击次数:111次

      食品中化学污染物检测在保障食品的安全中发挥着越来越大的作用。依赖于大型仪器如质谱、色谱、光谱的实验室分析检测技术准确、可靠,但存在对样品前处理过程繁琐、具有破坏性、消耗试剂、耗时长、成本高等缺点。而且所需仪器大都昂贵且庞大、笨重.只能在室内进行抽样检测,不适于现场检测,周期长、专业性强、费用高等不足。难以及时、快速地监控食品的安全状况.不适合进行大量样品的筛选,因此,简单快速的检测技术具有广阔的应用前景。以下简单列举当前在食品化学污染物检测领域得到应用的几种快速检测方法,这些方法有些已经被广泛验证采用而成为方法,有些则仍处于不断开发应用阶段。

I.酶抑制法

酶抑制法开始于20世纪60年代,80年代时得到了快速发展,是研究最多且相对成熟的快速检测的技术,检测对象主要包括农药和重金属。

在农药检测上,利用有机磷与氨基甲酸酯类农药可特异性地抑制昆虫中枢和周围神经系统中乙酰胆碱酯酶(acetyicholinestcrase,AChE)的活性,破坏神经的正常传导,使昆虫中毒致死这一毒理学原理。将AChE与样品反应,如果试样中没有农药残留或者残留量极少,AChE的活性就不被抑制;反之,如果农药残留量比较高,AChE的活性就会被农药所抑制。常用于农药残留检测的酶是动物酯酶和植物酯酶。酶抑制法能在半小时内快速测定蔬菜中有机磷农药及氨基甲酸酯类农药残留,已经成为国内外快速检测农药残留的主流技术。针对蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的快速检测,中国颁布了多个国家标准,如GB/T 5009.199—2003《蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的快速检测》、GB/T 18626—2002《肉中有机磷及氨基甲酸酯农药残留量的简易检验方法 酶抑制法》、GB/T18625—2002《茶中有机磷及氨基甲酸酯农药残留量的简易检验方法 酶抑制法》、GB/T18630—2002《蔬菜中有机磷及氨基甲酸酯农药残留量的简易检验方法酶抑制法》以及农业部标准:NY/T 448 —2001《蔬菜上有机磷和氨基甲酸酯类农药残毒快速检测方法》。基于酶抑制剂法的原理,国外已开发出相关的用于农药残留检测的速测箱、速测仪及配套的试剂盒和速测卡,且操作性能已日臻完善。

国内外实践证明,酶抑制法快速检测农药残留技术是控制有毒蔬菜产品进入市场和餐桌的有效手段,也是进行无害化生产的有力措施。该方法可作为传统仪器分析方法的有益补充,是目前应用最广泛的快速分析方法,已越来越多地进入各地蔬菜基地、批发市场和超级市场,进行农药残留检测。酶抑制法最大的优点是前处理简单、检测时间短、不需昂贵的仪器、易于掌握推广,特别适合现场检测以及大批样品的筛选。但是酶抑制法测定样品和农药种类有限.目前只适用于蔬菜、水果中有机磷和氨基甲酸酯类农药的残留检测,并且该方法使用的酶、底物、显色剂有一定的特异性。需控制的条件比较多,易出现假阳性或假阴性现象。另外其灵敏度、重复性、回收率还有待提高。

酶抑制法测定重金属的原理和测定农药相同,重金属能与酶活性中心的巯基或甲巯基键合,引起酶活力的下降,使底物一酶反应系统中的pH、颜色和电导率等理化参数发生变化。早在20世纪50年代就有学者提出运用酶抑制法来检测环境中的有害物质。其中.脲酶由于其对重金属的高灵敏度而被广泛应用。此外。相较于游离态,经固定化的脲酶可与光电传感器相结合,操作自动化程度高,重金属检出限更低,且稳定性、结果的可重现性也更好,因此在检测中的应用更为广泛。除了脲酶以外,其他酶如过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、乙酰胆碱酯酶、磷酸酯酶等,也越来越多地被用来检测重金属。

近年来,蛋白酶也被用于测定环境中的重金属,通常以酪蛋白一考马斯亮蓝体系作为反应底物,具有较高的有害物质相容性、较广的pH活性范围、较强的温度稳定性和相对较快的反应时间与传统速检测方法相比,酶抑制法检测重金属具有快速、简便、能实现在线检测等特点,近年来已经成为相关领域研究的一个热点。但由于不同重金属离子对于酶活性的抑制效应相差很大,重金属离子对酶活力抑制的广谱性,使该方法对单一重金属检测存在一定的困难,需要采用特殊预处理技术,如预先分离、“掩盖”干扰物等。另外,酶的使用方式(游离或固定)和检测方法(静态或流动)的不同也影响检测的准确性。因此,酶源的筛选、检测结果可重复性、样品提取以及与之相结合的酶传感器、试纸条、量热计、比色法等方面将会是今后进一步研究的方向。根据检测方式的不同,酶抑制法分为试纸法、光度法和pH计法等。

(1)试纸法

试纸法是将酶与底物分别固定在两片试纸上,两者接触时待测组分对酶的抑制作用产生催化显色差异,据此判断待测组分的含量。该法操作简单、成本低、易推广,适用于农贸市场、超市等食品集散地的实时监测。由于在检出限、保存性等方面存在局限性,该方法常用于食品安全的初筛检测。近年来的研究主要集中在试纸固定材料的选择、固定化技术的优化、测试形式的改进等方面。将脲酶、植物酯酶用纤维素膜固定,可提高酶的稳定性和敏感性,实现水中汞离子等有害因子的超灵敏检测。

(2)光度法

光度法通过选择合适的显色剂与酶的催化底物进行反应,考察固定时间内吸光度的变化,达到定性或半定量的目的。相对试纸法而言,光度法体系稳定性好、易于规范化,已广泛运用于食品安全检测中。光度法与试纸法一样均是我国运用最多的农药残留快速检测方法。不同酶源的活性、含量及其对农药的敏感度存在较大的差异,因此酶源的选择是酶抑制法,尤其是光度法的关键技术之一。自1953年从马血清中分离出胆碱酯酶后,快速检测中使用的酶主要来自动物及动物脏器和血液,如鸡肝、鸭血等,也有从鱼类和昆虫体内提取酯酶的报道。动物源酶应用广泛,制备简单,目前商品化的光度仪器多配备动物源酶。相比动物源酶的来源较少、保存困难,植物源酶的来源广、成本低、易保存。自20世纪70年代Kumar等利用淀粉中的酯酶制备薄层色谱用于对liu磷的检测后,各种植物酶源如大豆、玉米、小麦等的应用逐渐引起了重视,对于植物不同部位、不同生长期酶活性的差异也有报道。此外.一些微生物如从腐皮镰刀菌中提取的角质酶可作为酶源用于有机磷和氨基甲酸酯类农药的检测。有关酶的保存、测试条件的优化、仪器的改进等方面的研究使光度法趋于精细、稳定,适合于现场的快速检测。值得注意的是,使用光度法检测农药残留时,容易出现假阳性或假阴性现象。原因可能是:酶对不同农药的敏感程度不同,相差可达几个数量级,而农药残留国家标准集中在较小范围内,两者很难一致;国家标准是对单种农药的限量.而酶抑制法测出的是农药残留的总量,无法排除协同作用的存在;样品基体干扰.如辛辣物质、色素等会对分析结果产生影响。目前,还没有很好的方法可解决快速检测中的假阳性或假阴性现象,通过合适的样品前处理减少基质干扰并分离富集待测组分有可能减少假阳性出现.但这有待进一步研究。

(3)pH计法

当酶的活性受到抑制时,酶催化底物分解生成酸的量将减少,酶的抑制程度与反应体系的产酸量相关,由此可根据反应前后pH值的变化判定样品中待测物质的含量。pH计法设备简单、灵敏度高,满足国家规定的最大残留限量要求,但其测试过程粗略,实际应用很少,基于pH法原理制备的电化学传感器有较好的发展前景。

来源:(北京标准物质网)

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