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技术支持

WB 前传:你真的了解你的目的蛋白吗?
发布时间:2019-03-12   点击次数:74次

刚开始做 Western blot 的同学们想必都大多都是研究生,虽然科研经历还不是特别丰富,但情感经历一定都比较丰富吧。
同学们想想自己刚谈恋爱的时候,你刚喜欢一个人却还没表白之前,是不是每天都要想尽一切办法了解他/她的爱好,他/她的习惯,他/她每天的路线等等,等你心里有数之后再开始考虑如何表白?


做实验也一样,在开始 Western 之前,尽可能多的了解你的目的蛋白,这和谈恋爱一样,这样表白成功的概率才会大大增加。
当然,表白失败也很正常,我们之前做的功课只是增加成功的概率而已,并不能减少失败的概率,所以同学们做实验时也不要过于有心里负担,怕这怕那的,要保持一个自然的心态,否则容易抑郁。

今天我们就来看一看生物信息学的各种神器是如何来帮助我们的 Western blot 实验。大家在查找抗体的时候有没有看见免疫原的序列和这两个图标呢?

这个意思就是说厂家在生产这个抗体的时候,先是合成了一段肽链,这个肽链的氨基酸序列是从蛋白质序列里面摘录的,下面 blast with 意思就是分别和 NCBI 的数据库或 Expasy 的蛋白质数据库里的蛋白质氨基酸序列进行比对。
这个 blast 算法是比较复杂的,但对于我们医学科研来说,只需要知道 blast 就是一个序列比对的算法和工具就可以了。
前段时间有同学拿 α 肾上腺素能受体这个蛋白来问我,想得到一些指导,那么我就从以下五个问题来帮助他分析一下这个蛋白。



一:有没有这个蛋白的抗体?
我们以 Abcam 网站为例,简单搜索一下,发现有很多相关的抗体,对于受体这样丰都不高的蛋白质,还是建议选择单克隆抗体。
二:蛋白在什么组织中表达?
这个同学拿这个蛋白来问我的时候说,想研究大脑里的表达情况。如果你没有太多时间去研究综述的话,*简单的办法就是看 wiki 百科了。从 wiki 的介绍里可以看到,这个受体在神经元里是能够表达的,所以这个问题就解决了。
三:蛋白在哪里?
这个从 wiki 百科句话我们就看到了,这是一个 G 蛋白偶联受体,肯定是一个跨膜蛋白无疑了,这也意味着这个蛋白不是那么容易做的。
四:如果是跨膜蛋白,跨几次?
既然是跨膜蛋白,跨了几次膜,有几个压基在胞外,有几个亚基在胞内?这时我们可以用 SOSUI 这个网站来查询。
五:蛋白的序列?分子量?PI?
我们先要从 NCBI 里查找一下这个蛋白质的氨基酸序列,我们以小鼠为例(mus musculus),如下图所示:
然后我们把这个序列贴到 SOSUI 里面:
然后接得到这这些结果:
从这个结果我们知道这个蛋白跨膜 7 次,在胞内有两个较大的亚基,因此我们选择裂解液至少也要用 RIPA 而不能用 NP40,否则不能把这个蛋白从细胞膜里面拽出来,或者需要用专门的膜蛋白提取试剂盒来操作。


选抗体的时候需要注意一下它的免疫原氨基酸序列是否是胞内的氨基酸序列,因为这样抗体识别的效果是zui佳的。
然后我们要计算一下 PI,可以用这个工具:
输入氨基酸序列之后就得到了分子量和等电点 PI:
这个信息对于我们选择哪种转膜缓冲液非常有帮助。
如果 PI 接近转膜缓冲液的 pH 的话,蛋白质电离程度小,带的电荷就少,转印效率就会非常低。
所以对这种蛋白质,你选择常规的 pH8.8 的转膜缓冲液可能就不合适,至少应该选 pH11 的 CAPS 转膜缓冲液或者用 0.7% 乙酸的酸性转膜液效果才会比较好。
否则不管你转膜时间多长,蛋白质都在凝胶里一动不动,显然实验室不会出结果的。如果你用酸性转膜液的话,记得把膜放在凝胶的上面,因为此时蛋白质是往负极

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