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技术支持

蛋白质沉淀浓缩方法---节盐析法
发布时间:2019-03-08   点击次数:73次

一般来说,所有固体溶质都可以在溶液中加入中性盐而沉淀析出,这一过程叫盐析。在生化制备中,许多物质都可以用盐析法进行沉淀分离,如蛋白质、多肽、多糖、核酸等,其中以蛋白质沉淀*为常见,特别是在粗提阶段。

盐析法分为两类,类叫Ks分段盐析法,在一定PH和温度下通过改变离子强度实现,用于早期的粗提液;第二种叫Kb分段盐析法,在一定离子强度下通过改变PH和温度来实现,用于后期进一步分离纯化和结晶。

一.影响盐析的若干因素

1.蛋白质浓度

高浓度蛋白溶液可以节约盐的用量,但许多蛋白质的b 和Ks常数十分接近,若蛋白浓度过高,会发生严重的共沉淀作用;在低浓度蛋白质溶液中盐析,所用的盐量较多,而共沉淀作用比较少,因此需要在两者之间进行适当选择。用于分步分离提纯时,宁可选择稀一些的蛋白质溶液,多加一点中性盐,使共沉淀作用减至限度。一般认为2.5%-3.0%的蛋白质浓度比较适中。

2.离子强度和类型

一般说来,离子强度越大,蛋白质的溶解度越低。在进行分离的时候,一般从低离子强度到高离子强度顺次进行。每一组分被盐析出来后,经过过滤或冷冻离心收集,再在溶液中逐渐提高中性盐的饱和度,使另一种蛋白质组分盐析出来。

离子种类对蛋白质溶解度也有一定影响,离子半径小而很高电荷的离子在盐析方面影响较强,离子半径大而低电荷的离子的影响较弱,下面为几种盐的盐析能力的排列次序:磷酸钾>硫酸钠>磷酸铵>柠檬酸钠>硫酸镁。

3.PH值

一般来说,蛋白质所带净电荷越多溶解度越大,净电荷越少溶解度越小,在等电点时蛋白质溶解度*小。为提高盐析效率,多将溶液PH值调到目的蛋白的等电点处。但必须注意在水中或稀盐液中的蛋白质等电点与高盐浓度下所测的结果是不同的,需根据实际情况调整溶液PH值,以达到的盐析效果。

4.温度

在低离子强度或纯水中,蛋白质溶解度在一定范围内随温度增加而增加。但在高浓度下,蛋白质、酶和多肽类物质的溶解度随温度上升而下降。在一般情况下,蛋白质对盐析温度无特殊要求,可在室温下进行,只有某些对温度比较敏感的酶要求在0-4℃进行。

二.硫酸铵的使用

硫酸铵中常含有少量的重金属离子,对蛋白质巯基有敏感作用,使用前必须用H2S处理:将硫酸铵配成浓溶液,通入H2S饱和,放置过夜,用滤纸除去重金属离子,浓缩结晶,100℃烘干后使用。另外,高浓度的硫酸铵溶液一般呈酸性(PH=5.0左右),使用前也需要用氨水或硫酸调节至所需PH。

硫酸铵的加入有以下几种方法:1)加入固体盐法用于要求饱和度较高而不增大溶液体积的情况;2)加入饱和溶液法用于要求饱和度不高而原来溶液体积不大的情况;3)透析平衡法先将盐析的样品装于透析袋中,然后浸入饱和硫酸铵中进行透析,透析袋内硫酸铵饱和度逐渐提高,达到设定浓度后,目的蛋白析出,停止透析。该法优点在于硫酸铵浓度变化有连续性,盐析效果好,但手续烦琐,需不断测量饱和度,故多用于结晶,其它情况少见。

使用固体硫酸铵时:1)必须注意饱和度表中规定的温度,一般有0℃或室温两种,加入固体盐后体积的变化已考虑在表中;2)分段盐析中,应考虑每次分段后蛋白质浓度的变化。一种蛋白质如经二次透析,一般来说,次盐析分离范围(饱和度范围)比较宽,第二次分离范围较窄。3)盐析后一般放置半小时至一小时,待沉淀完全后才过滤或离心。过滤多用于高浓度硫酸铵溶液,因为此种情况下,硫酸铵密度较大,若用离心法需要较高离心速度和长时间的离心操作,耗时耗能。离心多用于低浓度硫酸铵溶液。

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